Theo một nhà sử học cùng thời, Catherina de' Medici có tên khai sinh là Caterina Maria Romula di Lorenzo de' Medici, sinh ra tại Firenze, Vương quốc Ý, vào thứ Tư ngày 15 tháng 4 năm 1519. Trong năm ấy, mẹ của Catherine là Madeleine de la Tour d’Auverne mất ngày 28 tháng 4 khi mới 17 tuổi; Lorenzo II de' Medici, Công tước xứ Urbino, cũng lìa đời ngày 4 tháng 5, có lẽ do mắc bệnh giang mai[6], để lại đứa con đầu lòng trở thành trẻ mồ côi. Đôi vợ chồng trẻ này mới kết hôn năm trước như là một phần trong kế hoạch liên minh giữa François I của Pháp và Giáo hoàng Lêô X, bác của Lorenzo de Medici, nhằm chống lại Maximilian I, Hoàng đế Thánh chế La Mã thuộc dòng họ Habsburg. Sau khi mất cả cha lẫn mẹ, cô bé mồ côi Catherine trở nên một món hàng đắt giá trong các cuộc môi giới hôn nhân, được đặt dưới quyền bảo hộ của Giáo hoàng Lêô, người đã từ chối lời đề nghị của François I khi muốn nhận giáo dưỡng Catherine trong triều đình nước Pháp.[6]

Không giống bố mẹ và cũng không giống các con của mình, Catherina có sức khỏe rất tốt và cuộc đời trường thọ. Giáo hoàng Lêô đem Catherina về Roma, với nhiều kế hoạch đầy tham vọng cho cô. Ông phong Catherina làm Nữ công tước xứ Urbino (duchessa d'Urbino), với dự định sắp xếp cho cô kết hôn với Ippolito de' Medici, con ngoại hôn của người anh trai Giuliano di Lorenzo de' Medici của ông, rồi phái hai người đến cai trị xứ Firenze.

Lúc đầu, Catherina sống dưới sự chăm sóc của bà nội, Alfonsina Orsini. Sau khi Orsini mất vào năm 1520, bà được đem về sống trong nhà của người cô, Clarissa Strozzi, lớn lên với con cái của bà. Catherina dành một tình yêu đặc biệt cho các con của Strozzi cho đến cuối đời.

Sau cái chết của Giáo hoàng Lêô năm 1521, quyền thừa kế của dòng họ Medici bị đe dọa nghiêm trọng, vì người kế nhiệm của Giáo hoàng Lêô, Giáo hoàng Ađrianô VI, là người ủng hộ dòng họ Habsburg. Giáo hoàng muốn hủy bỏ tước vị Công tước của Catherine, nhưng khi Hồng y Giulio de' Medici được chọn để trở thành Giáo hoàng Clêmentê VII năm 1523, ông đã phục hồi tước quyền cho dòng họ Medici. Giành quyền bảo hộ Catherine, Giáo hoàng Clêmentê đem Catherine đến sống trong lâu đài Medici (Palazzo Medici Riccardi) ở Firenze, nhấn mạnh rằng "nữ công tước bé nhỏ", theo như cách gọi của người dân Firenze,[8] cần được phục vụ theo nghi thức vương giả.

Mặc dù ảnh hưởng của Clêmentê ngày càng gia tăng, giai đoạn này không phải là dễ dàng cho dòng họ Medici tại Firenze: họ thường bị cô lập trong suốt một chuỗi các cuộc chiến xảy ra giữa nước Pháp và Thánh chế La Mã. Hoàng đế tân cử của Thánh chế, Karl V, có lần đã bắt giữ và cầm tù cả Vua François lẫn Giáo hoàng Clemnent. Sau vụ cướp phá Roma năm 1527, dòng họ Medici bị phe Cộng hòa lật đổ tại Firenze, Clêmentê bị buộc phải tấn phong Karl làm Hoàng đế La Mã Thần thánh để nhận sự trợ giúp quân sự hầu chiếm lại thành phố[9]. Mặc dù Ippolito trốn thoát, nhưng Catherine bị bắt làm con tin và bị giải giao từ tu viện này đến tu viện khác[10]. Nhật ký của một nữ tu thuật lại rằng: "Bà quá dịu dàng và dễ mến đến nỗi các nữ tu làm mọi cách để xoa dịu nỗi buồn của bà".

Tháng 10 năm 1529, quân đội của Hoàng đế đến vây thành Firenze. Khi cuộc vây hãm kéo dài, nhiều người lên tiếng đòi đem Catherine ra xử tử trên vách thành hoặc bỏ vào nhà thổ. Khi binh lính đến đem Catherine vào tu viện Santa Lucia, cô chống cự, nhưng cuối cùng vẫn bị đặt trên lưng lừa dẫn độ trên đường phố, chịu sự sỉ vả và hăm dọa của đám đông đang giận dữ[11]. Mặc dù cố chống trả, nạn đói và dịch bệnh buộc thành phố phải chịu hàng phục ngày 12 tháng 8 năm 1530. Sau Hòa ước Barcelona, Clêmentê gọi Catherine về Roma và sắp đặt kế hoạch cho cô kết hôn.